Morfovirtual 2018
MORFOHISTOLOGÍA DEL DESARROLLO FOLICULAR EN HÍBRIDOS EXPERIMENTALES ENTRE Triatoma infestans (KLUG) Y Triatoma platensis NEIVA (HEMIPTERA: REDUVIIDAE)
Federico Fiad Barbery1, Fernando Carezzano Costa2, Ana López Loyola1, Miriam Cardozo Rodríguez1-3, Claudia Rodríguez Ardini2-3
1 Cátedra de Introducción a la Biología, Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.
2 Cátedra de Morfología Animal, Departamento de Diversidad Biológica y Ecológica, Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.
3 Instituto de Investigaciones Biológicas y Tecnológicas, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas es una afección parasitaria causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi Chagas 1909. Esta se encuentra ampliamente distribuida en el continente americano (Duque et al., 2011; Zingales et al., 2012), siendo uno de los problemas sanitarios de mayor importancia epidemiológica en Latinoamérica. El principal mecanismo de transmisión de T. cruzi en la naturaleza y en las áreas rurales, es a través de las heces de los triatominos (Guhl, 2007). Actualmente se conocen 140 especies ampliamente distribuidas en América continental e insular (Schofield & Galvão, 2009), consideradas todas como vectores potenciales de la enfermedad de Chagas (Jurberg & Galvão, 2006). Entre las especies exitosamente adaptadas al domicilio humano se encuentra Triatoma infestans Klug 1834. Esta se distribuye en gran parte del cono sur de América y es la especie de mayor importancia epidemiológica ya que se encuentra colonizando, en altas densidades, el domicilio y los anexos peridomiciliarios de las viviendas humanas (Brewer et al., 1983; Noerieau et al., 1997; 2005; Waleckx et al., 2012). Es una especie claramente antropofílica que además presenta índices significativos de infección natural por T. cruzi (WHO, 2007).
Triatoma platensis Neiva 1913 es una especie ornitófila, considerada una especie silvestre que invade y coloniza el peridomicilio. Su distribución geográfica comprende numerosas provincias argentinas (Canale, 2005). Además, ha sido citada para la región sur de Bolivia, Paraguay y el área oeste de Uruguay y Brasil (Galvão et al., 2003). En los ambientes silvestres se la encuentra asociada a nidos de aves de los distintos géneros de las familias Furnariidae y, más raramente, Psittacidae (Brewer et al., 1983), en los cuales Bar et al. (1986) y Martí et al. (2014) registraron además la presencia secundaria de Didelphis albiventris Lund 1840, principal reservorio silvestre de T. cruzi. En el peridomicilio se han reportado colonias en gallineros, donde llega a establecer profusas poblaciones coexistiendo, en algunos casos, con T. infestans (Salvatella, 1991).
En la naturaleza varios autores citan que ambas especies no solo comparten el hábitat peridomiciliario, encontrándose en gallineros la presencia de ejemplares híbridos (Salvatella, 1987), sino que además coexisten en el ambiente silvestre. Al respecto Martí et al. (2014) realizaron el primer reporte de ambas especies conviviendo en nidos de aves en la localidad del Palmar (Chaco, Argentina), con el hallazgo de ninfas de 5to estadio aparentemente híbridos. En relación al proceso de colonización del domicilio, la alimentación y la reproducción cobran especial importancia para las especies que se encuentran en los peridomicilios, ya que el éxito para invadir y colonizar un nuevo ambiente va a depender no sólo de la disponibilidad de alimento en el mismo, sino también de la capacidad reproductiva de cada especie (Daflon- Teixeira et al., 2009). Es por ello que estudiar aspectos relacionados con la reproducción contribuyen al conocimiento de la dinámica poblacional, de dispersión y la potencial adaptación a diferentes hábitats (Gurevitz et al., 2006).
El desarrollo folicular es un proceso que se encuentra altamente regulado por el estado nutricional del insecto y factores hormonales. Consiste en una serie de cambios morfológicos, morfométricos, histológicos y bioquímicos que sufren los ovocitos hasta alcanzar la madurez, pudiéndose dividir en tres fases: previtelogénesis, vitelogénesis y coriogénesis. La previtelogénesis se caracteriza por el aumento y evolución de orgánulos citoplasmáticos (Asín & Ayerbe, 1989), es un proceso de lento crecimiento en el que se acumulan organelas producidas en el germario y que son transmitidas al ovocito a través de los cordones tróficos (Raabe, 1986) una vez que la célula haploide alcanza un tamaño crítico, el canal nutricio degenera y comienza la fase conocida como vitelogénesis (Stoka & Salomón, 1987).
Durante la segunda fase del proceso, se genera el vitelo dentro del ovocito. El vitelo tiene como función alimentar al embrión en desarrollo y está formado por una fosfolipoglicoproteína que Telfer (1954) llamó vitelogenina sintetizada en órganos extraováricos tanto en insectos como en otros organismos ovíparos invertebrados y vertebrados. En triatominos esta proteína junto con lipoforinas (lipoproteínas ricas en fosfolípidos) son producidas en los cuerpos grasos y vertidas a la hemolinfa para luego ser transferidas a ovocitos que hayan finalizado la fase previtelogénica, también se almacenan enzimas como peptidasas y carboxilasas ácidas que las degradan liberando los nutrientes que el embrión necesita para crecer (Fruttero, 2010). El proceso por el cual los nutrientes ingresan al ovocito en desarrollo es la pinocitosis, la hormona juvenil actúa sobre receptores del epitelio folicular que se contrae creando canales (patencia) que permiten el paso de hemolinfa cargada de sustancias de reserva llegando a la superficie del ovocito para que ingresen hacia el citoplasma del mismos (Davey, 1974). Una vez dentro, los endosomas se unen entre sí para formar los gránulos de vitelo, dentro del mismo las vitelogeninas son modificadas y transformadas en vitelinas que se almacena para su posterior uso durante la embriogénesis (Tufail, 2008).
La entrada de material vitelogénico se prolonga hasta que el ovocito alcanza su longitud máxima. Cuando finaliza la vitelogénesis la membrana vitelina se condensa y las células foliculares depositan las distintas capas del corion dando inicio a la etapa conocida como coriogénesis (Stoka & Salomón, 1987). Al finalizar la última fase de desarrollo el huevo, éste está listo para ser ovulado, el tapón epitelial degenera y se produce la apertura del canal que comunica con el oviducto lateral por donde será transportado pasando por el oviducto común, una vez que llega a la bursa copulatrix se produce la fecundación. En este momento el huevo ya fecundado está totalmente desarrollado y listo para ser ovipuesto, nutrir y permitir el crecimiento del embrión finalizando el evento reproductivo.
OBJETIVO
Caracterizar aspectos morfohistológicos de la biología reproductiva de híbridos experimentales de T. infestans y T. platensis enfocados en el desarrollo folicular.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para obtener los triatominos híbridos se formó una colonia fundadora de 20 hembras adultas de T. infestans provenientes de campo y 20 machos adultos de T. platensis de primera generación obtenidas en laboratorio, todos como ninfas quinto estadio. Los triatominos híbridos obtenidos fueron mantenidos hasta el cuarto estadio en el laboratorio de cría del Centro de Referencia de Vectores (CEREVE, Ministerio de Salud, Santa María de Punilla, Córdoba, Argentina). A partir del quinto estadio ninfal los insectos fueron sexados (Brewer et al., 1983) y trasladados al Laboratorio de Cría de la Facultad Ciencias Exactas, Físicas y Naturales de la Universidad Nacional de Córdoba en el cual se mantuvieron hasta la muda al estado adulto.
En ambos laboratorios los insectos fueron mantenidos en frascos de vidrio cilíndricos (500 cc), cubiertos por una red de plástico y provistos de un papel en posición vertical, bajo condiciones controladas de temperatura (27 ± 1°C), humedad relativa (60 ± 10%) y fotoperíodo (12:12 luz-oscuridad). Cada 15 días se les ofreció alimento sobre paloma (Columba livia Gmelin 1789) con movimiento restringido y sin anestesiar.
Para determinar el desarrollo folicular de los híbridos, se analizaron los cambios histológicos que ocurrieron en los folículos basales. Para ello se emplearon hembras alimentadas a repleción al séptimo día posterior a la muda y emparejadas con un macho híbrido bien alimentado. Una vez comprobada al menos una cópula, a través de la presencia del espermatóforo, el macho fue retirado. Luego de la primera alimentación y transcurridos 40 días de ayuno, a los fines de asegurar el vaciamiento del promesenterón y llevar los ovarios a un estado basal, las hembras fueron nuevamente alimentadas (Catalá de Montenegro 1983; 1989).
A partir de la segunda alimentación las hembras se sacrificaron. De cada ejemplar se extrajeron los ovarios y se fijaron en buffer fosfato salino (PBS) a pH=7. Para describir las características morfohistológicas, los ovarios de un ejemplar por grupo se deshidrataron en soluciones de alcohol de graduación creciente, se aclararon en xilol e incluyeron en parafina. Posteriormente se realizaron cortes a 7 μm y se colorearon con hematoxilina-eosina (Tolosa et al., 2003). A partir de los mismos se obtuvieron fotografías empelando una cámara digital AxioCam Erc 5s Carl Zeiss adosada a un microscopio Primo Star Carl Zeiss. A partir de las fotografías se ordenaron las distintas fases del desarrollo folicular.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El proceso de desarrollo folicular comenzó con los ovocitos de los folículos basales en previtelogénesis temprana, fase caracterizada por presentar un ooplasma de estructura fibrosa y homogénea, y un volumen muy reducido, además de carecer de gránulos de vitelo en su interior (Fig. 1A). Nutriendo a la gameta en ésta fase se encontró el cordón trófico que conecta a la célula en desarrollo con el estroma del germario, el mismo manifestó características histológicas similares a las observadas para el ooplasma (Fig. 1B). Luego los ovocitos mostraron un importante crecimiento en volumen, el citoplasma aumentó mucho de tamaño debido a la acumulación de nutrientes provenientes del germario conservando la estructura fibrosa, finalizando la fase de previtelogénesis (Fig. 1C). Cuando los ovocitos crecieron lo suficiente, entraron en fase de vitelogénesis temprana y los cordones tróficos degeneraron. A medida que se almacenaron los gránulos de vitelo desde la periferia, el ooplasma se fue recluyendo hacia el centro (Fig. 1D). Una vez finalizado el proceso de acumulación de vitelo, el interior de la gameta se encontró completamente lleno de gránulos y sustancias de reserva que aumentaron rápidamente su volumen en vitelogénesis tardía (Fig. 1E). En este momento el ovocito está listo para la producción de corion secretado por el epitelio finalizando el proceso de desarrollo folicular.
En relación al desarrollo del epitelio folicular se pudieron observar cambios en las diferentes fases de desarrollo. En previtelogénesis temprana, el folículo basal presentó un epitelio simple de células pequeñas y fusiformes, mononucleadas con núcleo también fusiforme y pequeño con cromatina condensada denotando poca actividad (Fig. 2A). Una vez que comenzó el desarrollo, las células del tejido se volvieron cilíndricas altas con núcleos redondeados en posición central y cromatina laxa encontrándose en fase de previtelogénesis tardía (Fig. 2B). Posteriormente, el ovocito comenzó a almacenar gránulos de vitelo en la vitelogénesis temprana, a nivel del epitelio ocurrió división mitótica, de modo que todas las células se observan como binucleadas, voluminosas y cilíndricas con limites nítidos, presentando su extremo basal en contacto estrecho con el espacio perioocítico y el extremo apical en contacto con la membrana peritoneal que separa al ovocito de la hemolinfa, además el volumen de ambos núcleos también aumentó observándose una cromatina aún más laxa que en la fase anterior (Fig. 2C). En la fase de vitelogénesis tardía, se produjo un estiramiento del epitelio folicular producto del aumento rápido de volumen que sufrió la gameta por el ingreso de sustancias de reserva y agua generando un achatamiento del tejido, en esta situación las células se volvieron cúbicas, de menor tamaño manteniendo el carácter binucleado con núcleos pequeños y redondeados (Fig. 2D).
CONCLUSIONES
Los cambios ocurridos a nivel histológico en los folículos basales se asemejaron a otros triatominos así, al igual que Triatoma infestans (Barth, 1973) y Rhodnius prolixus Stål, 1859 (Vanderberg, 1963; Huebner et al 1972), las fases de desarrollo folicular se encontraron bien definidas presentando una fase inicial de previtelogénesis en la cual el ovocito mostró un citoplasma filamentoso de volumen reducido, al igual que lo reportado por Barth (1973) para T. infestans y Huebner et al. (1972) para R. prolixus, además fue clara la presencia de un cordón trófico que nutrió al ovocito durante esta primera fase característico de un ovario telotrófico. Durante la fase de vitelogénesis, los núcleos del epitelio folicular experimentaron una mitosis sin citocinesis que produjo un tejido con células binucleadas.
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Figura 1: Secuencia de desarrollo folicular en ovarios de hembras híbridos de T. infestans y T. platensis (A-E). A: ovocito en previtelogénesis temprana (corte transversal) (10X HE). B: ovocito en previtelogénesis temprana (corte longitudinal) (20X HE). C: ovocito en previtelogénesis tardía (20X HE). D: ovocito en vitelogénesis temprana (10 X HE). E: ovocito en vitelogénesis tardía (10X HE). Mp: membrana peritoneal; Ef: Epitelio Folicular; Po: espacio perioocitico; Oo: ooplasma; Ct: cordón Trófico.
Figura 2: Secuencia de desarrollo de las células del epitelio del folículo basal en ovarios de hembras híbridos de T. infestans y T. platensis (A-D). F: epitelio folicular de ovocito en previtelogénesis temprana (80X HE). B: epitelio folicular de ovocito en previtelogénesis tardía (80X HE). C: epitelio folicular binucleado de ovocito en vitelogénesis temprana (80X HE). D: epitelio folicular de ovocito en vitelogénesis tardía (80X HE). N: núcleo; Po: espacio perioocitico; Oo: ooplasma; Vt: vitelo.